·药学专题·

周围神经错配研究方法进展*

高玉青1 综述,万 东2,祝慧凤1△ 审校

(1.西南大学药学院暨中医药学院,重庆 400716;2.重庆医科大学附属第一医院重症医学科,重庆 400016)

[关键词] 周围神经系统疾病; 神经生物学; 神经再生; 综述

周围神经错配是指再生周围神经的轴突朝着错误的方向生长,导致再生神经无法支配原先的靶组织和靶器官的一种常见病理现象。周围神经错配通常可分为异种神经间的错配和同种神经间的错配。异种神经间的错配即感觉神经错向长入运动支的神经内膜管,或运动神经错向长入感觉支的神经内膜管[1]。而同种神经间的错配常常是再生神经对接错误的靶器官所致。例如,坐骨神经的远端可分为胫总神经和腓总神经,二者支配小腿和足的全部肌肉,如果在恢复过程中运动神经错接到附近肌肉,可能导致诸如脚无法抬起;腕神经中感觉神经间的错接可能会导致神经修复后手指疼痛和麻木。周围神经损伤后功能恢复不理想,很大程度上与再生过程中发生错配有关。

本文围绕神经错配相关的常规检测方法、神经逆行示踪技术及特定模型构造3方面进行综述,以期为今后的研究提供一些启发。通过对神经错配的研究方法进行总结,可提供详尽的方法学参考,在很大程度上规避方法选择不当所造成的风险。此外,神经错配作为周围神经损伤恢复的一项重要评价指标,囿于现有临床检测手段易被忽视。因此,总结周围神经错配的研究方法对评价究周围神经的再生状况和评估神经损伤干预手段的治疗效果有重要意义。

1 常规检测方法

神经错配的常规检测方法可简单分为功能检测和形态观察,其中功能检测通常采用电生理学检测、行为学研究来衡量再生神经的功能恢复,而形态学观察则着重于再生神经形态数目,二者有机结合能够客观地评价神经的再生情况,间接反映神经的错配程度。

1.1 功能检测

1.1.1 电生理学检测 电生理学检测从测定神经再生纤维的神经传导速度(NCV)和兴奋性开始,不断向前发展。目前,电生理学检测已成为诊断周围神经损伤和评价周围神经再生的常用方法之一,主要是记录复合神经动作电位(CNAP)、NCV、体感诱发电位(SEP)和肌电图(EMG)等。

CNAP是指由许多兴奋阈值、传导速度、幅度不同的神经纤维产生的动作电位综合而成的复合动作电位变化。CNAP的潜伏期是神经纤维传导速度的量度,其波动幅度则是传导轴突数量的量度。比如通过测量所得的复合肌肉动作电位(CMAP)的EMG,可评估恢复功能的神经肌肉接头的相对数量。2018年,TAKEUCHI等[2]还建立了一种通过CMAP评估啮齿类动物面神经重建和再生的方法。目前,CMAP检测法被广泛应用于多种外周神经检测。但是,分析CMAP结果必须谨慎,因为随着运动单元尺寸的增大,受损神经的CMAP读数误差也会增大。这种现象会掩盖重新神经支配的运动单位数量的差异,最高可达25%[3]

NCV是指单位时间内神经冲动在神经上传导的距离,是检查神经传导性和兴奋性的定量方法,包括运动NCV和感觉NCV,二者分别用于评价低位运动神经元和感觉神经的功能。受损NCV的恢复标志着神经冲动的顺利通过,可作为早期观察神经再生、判断神经损伤与功能恢复的一项可靠指标。但NCV主要反映神经干中粗直径及快传导纤维的情况,不能从整体上反映再生情况,而且受温度、年龄、解剖变异、距离测量准确性等多种因素的影响。

SEP是在NCV之后出现的电诊断技术, 其可以反映中枢神经与周围神经之间的联系。值得注意的是,SEP受年龄、身高肢长、性别、测定电极的放置部位等影响,在诊断时应综合分析,定期复查。EMG则是将肌肉兴奋时发出的生物电变化引导出来,并加以放大后获得的图形,其可以反映与运动神经相连的靶肌肉的相关情况。

总体而言,电生理学检测是一种灵敏且较为准确的定量方法,可以判断神经传导功能的产生,但不能判断该神经的支配特性。当感觉支与运动支错接生长,或出现再生迷路等情况时,电生理学检测能够检测再生神经的传导信号,但其检测结果可能与功能恢复情况不符。

1.1.2 行为学研究 目前,周围神经损伤行为学研究主要集中在下肢的功能恢复方面,其最常用的方法包括足迹分析法和步态分析法。近年来,随着电子信息技术的发展,衍生出了一些研究周围神经损伤行为学的商业分析系统[4]

足迹分析法主要是通过测量足趾间距(2~4 趾和1~5趾)来观察钳夹损伤后神经功能恢复情况。通过对正常及神经损伤(横段、钳夹)后大鼠足迹进行研究,研究人员得出了坐骨神经功能指数(SFI)的计算方法,并将其用来观察坐骨神经相关肌肉的肌力恢复情况。SFI的计算主要采用1989年BAIN等[5]的修正公式,而国内测定SFI所用的足印行走箱,主要是依照1995年沈宁江等[6]的简便方法:在测量足印时,可采用显影剂、溴酚蓝、油和墨水等。随着录像技术在行为学中应用,静态坐骨神经指数(SSI)得以提出[7-8]。随着数码技术的发展,章明星等[9]研制了一种简易的步态分析装置,采用数码技术和图像处理软件(Adobe Photoshop CS)对大鼠后足长度、宽度进行测量,以此计算SFI。

足迹分析法常常会受到动物肢体痉挛和足趾缺失的干扰。此外,大鼠足迹缺失、不完整或足迹过长(常常出现在大鼠行走的开始和结束阶段)等也会造成足迹分析误差[10]。WALKER等[11]将足迹分析法进行改进,建立了步态分析法,用于评定坐骨神经的损伤和恢复。步态分析法是对动物行走规律进行研究的分析方法,其检测指标涉及步长、步幅、行走周期、足底压力等多种步态参数[12]。该方法用于评价动物功能恢复,不同动物间差异较小且检测全面,显著优于足迹分析法。但步态分析法仅着眼于远端足部肌肉的恢复,无法反映损伤(尤其是横断损伤)处肌肉功能恢复情况。

目前,行为学研究已有较为成熟的商业运动分析系统问世,如CatWalk系统、DigiGait系统,其主要是让大、小鼠行走或奔跑一段距离,通过记录脚印面积、尺寸、压力、触地速度、支撑方式、支撑时相与摆动时相及比值等参数,综合分析实验动物姿势和动力学,评估实验动物运动能力。这些商业三维运动分析系统大大降低了实验动物行为学分析中主观因素的影响,使行为学的研究结果变得易于重复和验证,可观察许多人眼难以直接观测的指标,如肌肉协调性等。

目前,步态分析法在临床上被广泛用于脑瘫儿童治疗评估及骨关节炎、脑卒中、帕金森、假肢适配等多个方面。在某些国家,步态分析法是脑瘫儿童进行手术治疗的一种必要诊断方法。我国已有多家单位(如上海交通大学、上海阳光康复中心)等引进了运动捕捉系统,建立了三维步态实验室,并开展了相关的临床应用和科研工作,取得了不错的成果[13]

在功能学检测方法中,有的方法无法直接归类到上述两类中,如夹点法、针刺法、反射检测法、伊文斯蓝渗透检测法及肌张力和重量测定法。这些方法一般用于判断轴突的再生程度或再生神经与靶器官间的联系。多种方法结合检测可以更为准确地评价神经损伤的恢复情况。

再生修复的根本目的在于提高功能的恢复,因此最为理想的功能恢复指标是行为学指标,具有无创测定的优点。行为学指标除反映肢体肌力恢复情况外,还可反映肌肉间的协调功能,并能随时进行动态观察,进行定性分析。虽然目前行为学研究正朝精确定量方面发展,但还存在测定受控条件多、方法不够灵敏等诸多问题。

1.2 形态学研究 神经组织的形态学研究方法主要依靠电镜法、化学染色法、酶组织化学法及免疫组化法,是对神经组织结构的静态研究。

神经组织的基本结构可以由电镜观察到。根据电镜结果可以观察神经纤维的排列,判断神经纤维髓鞘的有无,测定髓鞘的厚度,并对有髓神经纤维进行计数[14]。应用化学染色方法可以直接观察再生神经纤维和轴突的形态与数目。20世纪初,RAMONY CAJAL用镀银染色法首次观察到了再生神经的形态[15],所得结果中混乱的再生神经纤维证实了错配神经的存在,但无法提供更多的错配信息。酶组织化学染色法主要是通过神经内特定酶含量的不同,来区分运动神经和感觉神经,其常用的方法主要有2种:胆碱酯酶染色法和碳酸酐酶染色法,二者分别用于区分感觉神经纤维和运动神经纤维。罗鹏等[16]评估了几种酶组织染色方法在周围神经虚拟三维重建中应用的可行性,结果发现,乙酰胆碱酯酶染色和碳酸酐酶染色部位与背景区域视觉差异并不明显,而Karnovsky-Roots染色和胆碱乙酰转移酶染色部位与背景区域视觉差异明显。免疫组织化学法是利用组织中特异性抗原制备特异性抗体,作为相应神经标记物,通过抗原抗体的特异性反应来区分感觉神经纤维和运动神经纤维。

形态学研究可以从微观层面把握再生神经的相关细节特征,为神经再生过程中细胞水平的形态变化提供证据。但是,这些常规方法仍然不能准确量化神经错配的程度,不能显示神经与靶器官的关系。此外,组织形态学检查需要取材,会对生物体造成伤害。因此,在评价周围神经再生时应重视形态与功能指标结合,各取其优点。

2 神经逆行示踪技术

神经逆行示踪技术是通过神经轴浆流的逆行运输,将示踪剂从轴突运送到胞体用以研究目标神经元的一种方法。该方法通过在神经内注射荧光标记物或将神经断端浸泡于装有标记物的硅胶管,能追踪神经纤维束和其投射区,可以显示再生神经纤维间的联系(图1)。目前,神经错配的相关研究多采用神经逆行示踪技术,其可以简单分为顺序逆行示踪和同时逆行示踪。

1 神经逆行示踪法原理示意图

2.1 顺序逆行示踪 顺序逆行示踪是用两种不同的示踪剂,分别在神经损伤修复的前、后应用于同一神经分支,进行神经再生的准确判断[17]。双重标记的神经元数量与第一种示踪剂标记的神经元数量的比值可表示该神经重支配的准确度,该方法主要用以确定再生轴突长回原神经分支占初始神经元的比例。2006年,PUIGDELLVOL-SNCHEZ等[18]运用该方法对大鼠坐骨神经横断损伤后运动神经元再生的准确度进行了评估(图2),结果发现,仅有1/3的神经元被双重标记,这意味着坐骨神经横断损伤后运动神经元仅有1/3的再生轴突准确再生对接。

2.2 同时逆行示踪 同时逆行示踪是在受损神经修复后,同时对两种神经分支应用不同的示踪剂,以确定轴突从不同的神经分支再生的神经元数量,并通过双重标记的神经元数量占总神经元数量的百分比确定神经错配程度。该方法在坐骨神经、股神经、面部神经等多种动物实验模型中均有运用。在股神经[19]中,同时逆行示踪主要通过在感觉神经末梢和运动神经末梢给予不同的示踪剂,以确定轴突在不同神经分支上再生的神经元数量,其可进行再生轴突对某一神经分支的趋向性研究(图3)。在坐骨神经和面部神经中,同时逆行示踪主要是通过双标神经元的百分比确定神经主干中来自不同分支的再生神经元的分布情况和变化。

A:于造模前在大鼠胫神经处注射双脒基黄(DY)染色液,通过逆行运输,远端神经元的细胞核被染成黄色。B:横断大鼠右侧坐骨神经并缝合,构建坐骨神经损伤模型。C:在注射DY染色液的胫神经附近横断,在神经断端给予固蓝(FB)染色液,通过逆行运输,远端神经元的细胞质可被染成蓝色。结果显示,被DY和FB染色液双标的神经元实现了再生过程中的准确对接,而被单一DY和FB染色的神经元则提示了错配的存在

2 顺序逆行示踪技术评估大鼠坐骨神经横断损伤后运动神经元再生准确度

于股神经干损伤修复8周后,分别在股神经肌支和隐神经处标记逆行示踪剂1,1′-二(十八烷基)-3,3,3′,3′-四甲基吲哚羰基花青高氯酸盐(DiI,产生红色荧光)和F488(产生绿色荧光)。正常情况下脊髓前角内仅见红色标记的神经元;若脊髓前角内可见绿色标记的神经元,或将前两视野叠加有橙色标记的神经元则提示神经错配的存在

3 同时逆行示踪技术评价股神经的趋化性再生

神经逆行示踪技术的关键在于示踪剂的选择。由于神经示踪剂的标记效果和神经毒性各不相同,因此选择合适的示踪剂组合是确保实验结果准确的必要前提[20]。神经示踪剂包括辣根过氧化物酶、荧光示踪剂、生物素葡糖聚胺、病毒等。由于不同种示踪剂的组合常常难以在同一激发波长下被观察到,研究中多采用荧光示踪剂进行双重标记,如目前研究中频繁使用的荧光金(FG)、DiI、真蓝(TB)、荧光红(FR)等。YOU等[21]在2015年对上述4种荧光逆行示踪标记物进行了比较研究,结果发现,TB、FG和DiI这3种染料用于神经逆行示踪有着非常接近的标记效率,DiI和TB、DiI和FG是非常合适的双重标记组合。除此以外,FB和DY也是常用的组合。已有报道证实无论是单独使用这二者,还是按任何次序联合使用,被标记的神经元的数目都是一致的,而且在同一激发波长下,可观察到二者共同标记的结果[1]。虽然目前有许多示踪剂组合,其具体应用条件已被探索得较为清楚,但是在选用神经示踪剂时仍应仔细考虑诸如标记效果、潜在毒性、二者相互作用和半衰期等问题[22]。此外,神经逆行示踪技术可以准确显示异种神经的错配率,具有常规方法所无法比拟的优势。

3 特定模型

3.1 神经节选择性切除模型 2007年,王冠军等[23]构建了坐骨神经脊髓背根神经节(DRG)切除模型,并首次将其应用于对异种神经错配的定量研究。该方法是待研究的受损神经修复一定时间后切除该神经对应的脊髓DRG,待感觉神经纤维全部溃变后处死动物。经过上述处理后,再生神经中只留有运动神经纤维,这样能够特异性地区分感觉神经纤维和运动神经纤维,计数分析正常(运动)和溃变(感觉)神经元的数目,可算出神经纤维再生错接率(图4)。

但该方法操作不当会引起大鼠气胸、脊髓损伤、出血过多等问题,造成实验动物死亡。其次,损伤神经的选取不当也会增加实验误差。2010年,夏红霞等[24]认为坐骨神经分支多,实验干扰大,股神经模型更适合。2013年,彭建平等[25]通过选择性切除股神经腹根/DRG获得单纯感觉神经/运动纤维动物模型,结果发现,术后4周时,退变的轴突及髓鞘已完全清除,可获得良好的单纯性质周围神经,以此方法制作的单纯感觉/运动神经纤维动物模型稳定可靠。2018年,安普天等[26]将该模型用于研究运动训练对运动功能的影响,排除了相关感觉神经的干扰。

A:正常腓肠神经髓鞘染色(200×),可见大量的有髓神经纤维,蓝色的髓鞘环绕轴突呈环状。B:DRG切除后3周,腓肠神经髓鞘染色(200×),可见髓神经纤维髓鞘降解、模糊、环状结构消失

4 切除腰46脊髓DRG后对坐骨神经的趋化性再生定量研究

3.2 周围神经三维可视化模型 周围神经受损后远近端形态的改变与神经再生及功能恢复之间关系密切。周围神经三维可视化模型可以真实再现周围神经复杂的三维表面结构及毗邻关系,打破了传统方法无法观察立体结构的局限。

建立周围神经三维可视化模型主要依靠周围神经标本获取、功能束识别、功能束识别后二维图像的获取、二维图像处理(分割和配准等)、三维可视化系统的建立这一流程,其中,功能束识别对神经错配的研究尤为重要。目前,神经纤维的错向生长、交叉吻合的程度均无法在现有二维神经断面图像上得到反映。因此按功能对神经束组进行科学分类,精确重建神经内部立体结构,使同种的神经束组能够精准对合,才能避免神经纤维对合错误与错向生长所导致的种种问题[27]

一般来说,用于周围神经三维重建工作中鉴别神经束性质的方法应满足以下条件:能明确定性不同性质周围神经功能束;能对周围神经内部的功能束进行定位;可以形成易为计算机图像识别系统识别的二维图像。常用的功能束识别方法包括解剖组织学法、电生理学法、酶组织化学法、放射生物化学法和免疫组织化学法等。解剖组织学法和电生理学法准确性欠佳,不适用于周围神经三维重建。酶组织化学法中只有Karnovsky-Boots法兼有简单易行与鉴别效果良好的特点。放射生物化学法虽可以区分感觉神经和运动神经,但需要将组织匀浆不能得到二维图像,用于区分单一性质的神经尚可,对于定性定位混合神经内的功能束的鉴别则不够理想。免疫组织化学法特异性强、快速、重复性好,动物实验结果不错,值得深入研究[28]

对周围神经再生过程进行三维重建,能较好地显示再生神经纤维各组织结构的形态特征及其通过吻合界面的过程,而且再生神经纤维与正常神经纤维的差异也能得到很好的体现[29]。2017年,BIKIS等[30]利用微型计算机断层扫描系统,无需切割和染色就能实现周围神经的三维、无损成像和后续自动分析评估。但由于周围神经三维重建与可视化研究兴起不久,周围神经的信息识别、分割、配准和融合等问题尚未解决,影响了周围神经三维重建的发展,该领域仍处于发展阶段[31]

3.3 荧光转基因动物模型 2003年,LICHTMAN等[32]建立了荧光转基因的小鼠模型,使其运动神经元表达绿色荧光蛋白或其变异体,创造了一种运动神经终端成像的新方式。将该方法与突触后膜的对比染色结合,可以观察到活体动物中的突触前后部分,这使得对于神经肌接头和运动单元的生长、成熟、重建、再生过程进行短至数秒、长达数月的观察得以实现。2007年,HAYASHI等[33]建立了双重转基因小鼠模型,通过调控thy1-CFP(23)/S100-GFP基因,使小鼠雪旺细胞持续表达绿色荧光蛋白,而轴突表达蓝色荧光蛋白。该法可用于追踪雪旺细胞的迁移和评价神经的再生情况(图5)。

桥接手术后5 d:A.雪旺细胞显示绿色荧光;B.轴突显示蓝色荧光。桥接手术后10 d:C.绿色荧光蛋白标记的雪旺细胞充满了移植体;D.新生轴突不到移植体的一半长,生长最远端已用黄色箭头标出,其长度约为4 mm。桥接手术后15 d:E.移植体中绿色荧光蛋白标记的雪旺细胞密度有所增强,有所交汇;F.新生轴突已经横贯了移植体

5 thy1-CFP(23)/S100-GFP双重转基因小鼠模型

由于小鼠转基因模型难以满足周围神经再生过程的研究需求,为满足对下肢神经的再生过程进行准确研究,2012年,MOORE等[34]建立了荧光转基因的SD大鼠模型。通过控制thy1基因,使大鼠仅在神经组织中表达绿色荧光蛋白,使神经再生和运动终板的再生实现了在体观察,甚至可以观察到单根受损神经再生进入原先通路的过程,为神经错配研究提供了新模型(图6)。

目前,研究面神经的转基因大鼠模型早已构建成功[35]。2014年,Eva Placheta等将15只雄性Thy1-GFP大鼠用于研究面神经的再生,结果发现,大鼠面神经表达的绿色荧光蛋白能在面神经重建后的2、4、8周进行连续体内成像[36]。该研究中神经再生的距离超过了30 mm,能够满足临床相关检测的再生距离要求。

目前,国内已实现了活体小鼠坐骨神经的形态学观察。王天兵等[37]采用表达绿色荧光蛋白的转基因小鼠,建立了用激光共聚焦显微镜活体、实时观察周围神经形态的方法,观察到神经损伤即刻及损伤后2 h,损伤近端处逐渐出现空泡样变性、神经纤维走向的逐渐紊乱、部分纤维中断。该模型可用于观察小鼠损伤后周围神经结构的形态和变化。2016年,有研究采用荧光转基因小鼠,结合神经元功能的膜片钳数据与三维重建的细胞形态学数据,在细胞水平上建立了神经元结构和功能之间的联系[38]。此外,由于荧光转基因模型便于与其他检测方法联用,这种模型有望被发展成评估周围神经损伤治疗方案的标准模型。

A:在运动神经的两条分支及其相应的运动神经末梢可见绿色荧光蛋白表达。B:为标记突触后的乙酰胆碱受体,趾长伸肌用罗丹明-α-蛇毒素进行染色。C:合并突触前后的图像可见绿色荧光蛋白表达延伸至了神经末梢。D:对整个趾伸长肌进行观察发现,运动神经穿过肌肉与分支,并止于神经肌接头。所有富含乙酰胆碱酯酶的突触后位点均与表达绿色荧光蛋白的神经末梢重合,这提示支配肌肉的运动神经元表达绿色荧光蛋白(标尺长度=40 μm)

6 thy1- GFP荧光转基因SD大鼠神经肌接头的荧光共聚焦显微结果

4 小结与展望

目前,周围神经损伤的临床检测仍采用常规检测方法,仅能观察到神经错配的现象,而无法准确量化神经错配的严重程度。因而会出现虽然检测结果正常,但功能恢复不理想的情况。这些常规方法作为神经损伤恢复的评判手段不够理想和准确,因此周围神经错配研究方法的创新与发展对于临床诊疗有着重要的意义。神经逆行示踪技术的发展将有望实现神经错配的临床定量诊断,将有助于靶器官再支配的重建;周围神经三维可视化模型的建立能够清晰呈现错配点周围的神经毗邻关系和准确的三维结构,对临床诊断与教学而言大有裨益;荧光转基因手段的不断进步则提供了周围神经损伤恢复过程在体实时检测的可能。周围神经损伤临床诊疗的不断发展离不开周围神经错配检测方法的革新。

近年来,周围神经错配的研究领域取得了许多突破,如通过神经逆行示踪技术准确地反映异种神经错配的情况,但对于同种神经间和混合神经的错配仍然缺乏系统性的深入探索。此外,由于神经逆行示踪技术采用的标记物具有毒性和放射性,难以达到临床应用标准。同种神经间和混合神经的错配研究能否产生新的突破,能否开发出应用于临床的检测手段或仪器,能否直接观察周围神经损伤后神经纤维的再生恢复情况,这些都仍有待进一步探索。

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Progress in research methods of peripheral nerve mismatch*

GAO Yuqing1WAN Dong2,ZHU Huifeng1△

(1.Southwest University College of Pharmaceutical Sciences and Chinese MedicineChongqing 400716,China; 2.Department of critical medicinethe First Affiliated Hospital of Chongqing Medical UniversityChongqing 400016,China)

[Key words] Peripheral nervous system diseases; Neurobiology; Nerve regeneration; Review

[专家简介] 祝慧凤,医学博士,副教授,硕士生导师。重庆市卒中学会品质管理专委会第一届专业委员会副主任委员,世界中医药联合会亚健康分会常务理事,中国民族药理学会科普分会常务理事,中华中医药学会临床药理分会全国委员,脑病分会全国委员。国家自然科学基金评审网评审专家,多省市科技项目评审专家,国内外多家杂志期刊审稿人。主持各级科研项目10余项,其中国家自然科学基金面上项目2项,重庆市科技项目2项。发表科技论文100余篇,其中SCI论文20余篇。研究方向:脑血管疾病与中风后神经血管重塑机制,中医药防治中风等疾病的物质基础与药理机制,补益药与活血化瘀药。

*基金项目重庆市科技局基础与前沿研究计划项目(cstc2014jcyjA10083);西南大学第九届本科生科技创新基金重大项目(20162902001)。

通信作者,E-mail:zhfbsci@126.com。

DOI:10.3969/j.issn.1009-5519.2019.23.004

中图法分类号:R322.8

文章编号:1009-5519(2019)23-3578-06

文献标识码:A

(收稿日期:2019-03-20 修回日期:2019-08-26)